ROS原癌基因 1 (ROS1) 由位于染色体6q22.1的ROS1基因编码，属于酪氨酸激酶胰岛素受体亚家族，于1986年在涉及肌肉瘤RNA UR2肿瘤病毒的研究中首次被发现。ROS1的生理作用仍存在争议；其表达主要在肺组织中观察到，其次是宫颈和结肠。可以想象，酪氨酸激酶胰岛素受体在胚胎发育中起着关键作用。ROS1蛋白显示出与ALK（均属于胰岛素受体超家族）的大量同源性，特别是在ATP结合位点（84% 同源性）和激酶域（64% 同源性）。ROS1的融合突变是众所周知的，通常会导致与几个融合伙伴的基因融合，由此产生的融合蛋白是强大的致癌驱动因素。因此，ROS1激酶活性被持续激活，由于JAK/STAT、PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的上调，导致细胞增殖、存活和迁移增加。ROS1已在体外和体内显示出致瘤潜力，胶质母细胞瘤是第一个显示出具有 ROS1重排的人类癌症。随后在其他恶性肿瘤中观察到ROS1融合，包括 NSCLC、黑色素瘤和偶尔的胆管癌、血管肉瘤、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。ROS1改变既不能遗传也不能作为基因改变获得。
 

ROS1的重排约占NSCLC患者的2%，在NSCLC中常见的融合伙伴如下表所示，其中占比最高的是CD74基因。

Table 1. Main ROS1 fusion partners in non-small cell lung cancer (NSCLC).
 

 CD74位于染色体5q33.1，该基因编码的蛋白质与II类主要组织相容性复合体 (MHC) 相关，是调节免疫反应抗原呈递的重要分子伴侣。它还充当细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) 的细胞表面受体，当其与编码的蛋白质结合时，会启动存活途径和细胞增殖。这种蛋白质还与淀粉样前体蛋白 (APP) 相互作用并抑制淀粉样蛋白 β (Abeta) 的产生。

在非小细胞肺癌的诊断中，NCCN指南明确描述“ROS1 is a receptor tyrosine kinase that can be rearranged in NSCLC, resulting in dysregulation and inappropriate signaling through the ROS1 kinase domain.”强调了ROS1的分子诊断的意义，是必须要检测的一个分子marker，同时推荐的检测方法描述为“FISH break-apart probe methodology can be deployed; however, it may under-detect the FIG-ROS1 variant. IHC approaches can be deployed; however, IHC for ROS1 fusions has low specificity, and follow-up confirmatory testing is a necessary component of utilizing ROS1 IHC as a screening modality. Numerous NGS methodologies can detect ROS1 fusions, although DNA-based NGS may under-detect ROS1 fusions. Targeted real-time PCR assays are utilized in some settings, although they are unlikely to detect fusions with novel partners.”


全套合集之一：药靶模型
 

CD74-ROS1融合蛋白，可以组成型激活细胞增殖，选择在依赖IL3的BaF3细胞模型上，外源过表达CD74-ROS1蛋白，可以作为驱动基因，驱动Baf3细胞的增殖，而不需要IL3，因此可以用于针对CD74-ROS1的抑制剂的活性检测。基于以上的原理，科佰生物开发了CD74-ROS1/Baf3药靶模型，可以在In vitro层面检测样本的抑制活性，同样也可以在in vivo层面做CDX模型，检测药物的活性。


Fig 1. Sanger sequencing of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，左侧为CD74基因，右侧为ROS1基因。

Fig 2. Cell-based kinase assay of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，不同阳性药物对CD47-ROS1细胞增殖抑制的活性比较。


全套合集之二：DNA标准品

我们知道CD74位于5号染色体上，ROS1位于6号染色体上，CD74-ROS1融合是一种易位融合，常见的CD74(E6)-ROS1(E34)在临床病人的DNA测序上，CD74的断点是在6号内含子上，ROS1的断点是在33号内含子上，而且不同的病例，断点不唯  一，因此基于CD74-ROS1在DNA层面的标准品，首先肯定断点在内含子上，其次一种标准品仅代表一种断点。基于以上信息，科佰生物通过基因编辑技术开发定制了一款DNA层面的CD74(E6)-ROS1(E34)，通过sanger测序、ddPCR检测对DNA做定标，发布一款DNA标准品。


Fig 3. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，左侧为CD74基因，右侧为ROS1基因，断点为内含子断点。


Fig 4.ddPCR of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，检测显示该标准品突变频率为50%。


全套合集之三：RNA标准品

CD74-ROS1融合在病理上有意义，主要是因为融合蛋白的活性，也就是说，假设DNA层面出现融合，但是没有RNA，进而没有蛋白，其实也没有任何意义的，因此针对CD74-ROS1的RNA的检测，会更有意义。科佰生物通过基因重组的技术，在RNA层面定制出CD74(E6)-ROS1(E34)的细胞模型，再通过sanger测序，ddPCR检测对RNA做定标，发布一款RNA标准品。

Fig 5. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，左侧为CD74基因，右侧为ROS1基因，断点为外显子断点。


Fig 6. DdPCR of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，检测显示该标准品拷贝数为2244.5copies/ng。


全套合集之四：ddPCR试剂盒

不管是针对CD74-ROS1融合的药物研发，还是诊断，在各种应用检测中，都少不了PCR的检测技术，比如在药靶模型的构建中，我们可以使用PCR的技术看外源基因是否过表达，看阳性比例，筛选克隆，方法学优化等等，比如在诊断中，可以筛选阳性病人，性能评价，平时的质控等等。在PCR技术中，ddPCR是一种灵敏度高的绝对定量的一种方法，比起Q-PCR，灵敏度高，不需要做标准曲线，比起NGS，成本低，周期短，能快递出结果。科佰生物开发了针对DNA和RNA的ddPCR检测试剂盒，适用于在药物研发和临床诊断中的检测。



Fig 7. 针对CD74-ROS1的DNA层面ddPCR性能评价，使用标准品稀释到不同的%AF，在不同的%AF下显示准确的检测能力。


Fig 8. 针对CD74-ROS1的RNA层面ddPCR性能评价，使用标准品稀释到不同的拷贝数，在不同的拷贝数下显示准确的检测能力（注意RNA需要反转录为cDNA检测，反转录需要在完全相同的体系下开展）。