现有的针对ctDNA的MRD检测主要有2条技术路线：tumor-agnostic -assays(肿瘤未知分析)和tumor-informed assays(肿瘤知情/先验分析)，其中tumor-agnostic -assays仅对血浆检测，利用的是固定的panel（一般为驱动基因和靶向药物基因，也会多组学方法）和分析方法对ctDNA做检测，做分析，代表产品Guardant Health公司的Guardant Reveal；tumor-informed assays需要对原发肿瘤组织进行测序（一般为WES），来鉴定患者的特异基因组变异图谱，然后再定制个性化的panel，针对ctDNA做检测，也就是说需要对组织和血浆都做检测，代表产品为Natera公司的Signatera。国内IVD公司对MRD的检测，截至发稿前，小编遇到的tumor-informed assays为多。

Fig 1. 针对MRD的检测两种检测技术路线

MRD技术难度很大的一个方面是对超低频突变的检测能力和稳定性，以非小细胞肺癌为例，在早期NSCLC患者血浆中位cfDNA的浓度为7.69 ng/mL，换算在10 mL血浆(20ml全血)中含有大概20,000个单倍体基因组（3.3pg），考虑到cfDNA建库时的损耗以及至少存在2条相同的变异基因序列，10 mL血浆中ctDNA检测到的极限分子信号为0.02%水平，另外, 从TRACERx研究数据推算, 在1 cm3体积的肿瘤情况下, 10 mL血浆中大概含有2条肿瘤来源DNA分子。因此, 在NSCLC中进行MRD检测时, 该检测方法必须可稳定检测出丰度≥ 0.02%的ctDNA。这里有个重要的技术策略，就是Sample Level的策略，对于Site level的0.02%甚至更低，可以通过Samples Level来提高灵敏度。

针对ctDNA检测的MRD诊断IVD的开发，少不了的是性能评价，自然也是少不了标准品的开发，科佰生物是一家专注IVD研发中诊断阳性参考品、检测限参考品、精密度参考品的研发生产型企业，针对ctDNA的超低频标准品的开发，我们推出我们MRD的标准品：Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard

这是一款多基因多位点的panel标准品，基因和位点覆盖范围广，突变类型丰富，十分适合作为LDT和IVD检测的参考品、质控品。

科佰生物在其中挑选了40+位点（病理学分级意义的位点）开发ddPCR，采取Fig 2/Fig 3的策略对低频、超低频的位点进行定标：

Fig 2. Serial Dilution assay for MRD reference standard

Fig 3. 如何对低频、超低频的频率进行定标？科佰生物采取了1和4的方法开展定标。

科佰生物针对Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard的产品，选择了30+基因40+位点（部分基因位点ddpcr数据正在验证中），全部开发ddPCR检测体系，精确定标0.5%的频率波动，选择了6个基因7个位点作为0.05%的稀释倍数验证，选择2个基因2个位点作为0.005%的稀释倍数验证。

Table 2. MRD标准品-0.5%经过ddPCR精确定标的基因，黑色为0.5%的验证基因，红色是用于稀释倍数验证的基因。

Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard包含多种突变类型，有SNV/Insertion/Deletion/Fusion，在突变类型上，有Missense/Nonsense/Deletion - In frame/Deletion - Frameshift/Insertion - In frame/Insertion - Frameshift/Translocation/Spice-site等等，在临床的病理分级上基本都是Pathogenic/Likely Pathogenic，具体位点明细如下：

Table 3. Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard-0.5%的部分位点展示，黑色为目标位点，红色为用于稀释倍数验证的位点。

科佰生物内部还在进一步开发更多的位点，产品还会进一步升级。