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新型冠状病毒:用于诊断的假病毒标准品和用于药物研发的假病毒模型

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新型冠状病毒:用于诊断的假病毒标准品和用于药物研发的假病毒模型

  • 分类:公司动态
  • 作者:科佰生物
  • 来源:科佰生物
  • 发布时间:2021-07-06 15:23
  • 访问量:

【概要描述】

新型冠状病毒:用于诊断的假病毒标准品和用于药物研发的假病毒模型

【概要描述】

  • 分类:公司动态
  • 作者:科佰生物
  • 来源:科佰生物
  • 发布时间:2021-07-06 15:23
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截止今天,2019-nCoV已经在全球多国出现,在中国人教科书式的疫情战役之后,突然在韩国、日本、意大利、伊朗、新加坡等国家出现明显的确诊病例增长,显然这已经是全球所有人应该重视应对的问题了。

 

我们知道2019-nCoV具有很强的传染性,隔离措施是非常必要的,针对疑似病例诊断的可靠性就是重中之重了。在前段时间,我们发现临床的核酸诊断出现很大概率的假阴性,继而确诊时我们就结合了临床指标,确保每个病人能及时准确的得到治疗。

 

那我们不禁会问:核酸检测作为金标准,为什么会出现这么大的假阴性概率?原因是多方面的,比如取样部位的差异,潜伏期病毒滴度低,Q-PCR的相对定量判断原则,试剂盒的检测限等等。

 

 

科佰生物作为一家提供诊断标准品和药物研发模型的公司,今天就这诊断和药物研发两方面我们做下讨论。

 

我们可以分析下2019-nCoV的结构,与其他beta类冠状病毒一致,一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,其中关键的基因有ORF1ab、Gene S、Gene E、Gene M和Gene N。

 

1. ORF1ab包含RdRP(RNA-dependent RNA polymerase),RNA聚合酶用于RNA的合成,常被用于诊断;

 

2. S蛋白,穿过病毒膜,并在冠状病毒“冠状”中形成特征性的尖峰,它被高度糖基化,可能形成同源三聚体,并介导受体结合和与宿主细胞膜融合,刺激中和抗体的主要抗原以及细胞毒性淋巴细胞的重要靶标在S蛋白上,被用于药物研发。

 

3. 小包膜E(envelope protein)蛋白将其C末端留在包膜内,然后跨越该包膜或弯曲并在内部投射其N末端。

 

4. M蛋白(membrane glycoprotein)具有一个短的N末端结构域,该结构域在包膜的外表面上突出并跨过该包膜3次,在包膜内留有一个长的C末端,M蛋白在病毒装配中起重要作用。

 

5. 核衣壳蛋白N(nucleocapsid phosphoprotein)与RNA基因组结合形成核衣壳。它可能参与病毒RNA合成的调控,并可能在病毒出芽过程中与M蛋白相互作用。

 

 

用于诊断的假病毒标准品

 

根据WHO公布,全球的诊断主要是围绕N基因,另外附加其他的基因作为确认,对应的protocol,请点击查看

 

 

N基因,全长1260bp,以美国CDC为例,直接在N基因中选择了3对引物、探针,而且对N1、N2、N3都做了特异性比对分析和特异性检测分析,结论是N1和N2都是非常特异的,N3能同时检测SARS和bat SARS。

 

 

同样的CDC也做了检测分析,数据可以说是非常漂亮,展示了非常强的灵敏度:

 

 

但是我们发现整个性能评价,都是使用体外转录的N gene RNA,然后用人A549细胞和viral transport medium (VTM)来稀释,作为模拟病毒标准品做的。这样我们不经会问,是否有更合适的标准品用于性能评价?

 

按照2020年02月12号国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布的指导原则《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》中明确指出:阳性质控品可用1~2个病毒株为代表,应含有天然的或人工合成的包含试剂盒可检测靶序列(如假病毒),阴性参考品则主要涉及对交叉反应的验证情况,建议包括冠状病毒(HKU1、OC43、NL63、229E)、SARS冠状病毒(可采用假病毒)、MERS冠状病毒(可采用假病毒)、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

 

科佰生物应对核酸诊断的需求,开发了一系列的假病毒标准品(假病毒也是病毒,有核酸RNA和外壳蛋白组成,但是无致病性,只需P2级),帮助企业做试剂盒的性能评价,具体产品线为:

 

 

以2019-nCoV Gene N为例,假病毒包含全长1260bp,满足不同客户对不同序列的需求,假病毒含有Gene N1260bpRNA,同时也有完整的包膜结构,需要用试剂盒提取,反转录,开展下游的dPCR检测。我们采用了Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit提取,使用苏州锐讯开发的《新型冠状病毒(COVID-19)核酸检测试剂盒》一步法反转录,然后再PCR扩增仪(SG-200)上对病毒的拷贝数最绝对定量。

 

 

得到2019-nCov-N Pseudovirus Standard Reference的绝对拷贝数为5.03*10e8/ml。

 

 

用于药物研发假病毒模型

 

2月16日,美国德克萨斯大学奥斯汀分校和美国国家卫生研究院科研人员联合在预印本平台bioRxiv上发布了对2019新型冠状病毒的最新研究发现:他们确定了处于预融合构象的2019新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的冷冻电镜结构,同时发现,人体ACE2蛋白与新型冠状病毒S蛋白结合的亲和力,比与SARS病毒S蛋白结合的亲和力高10到20倍。

 

S蛋白通过其受体结合区识别ACE2,因此,研究人员就以受体结合区为靶标制备抗体,目的是阻断受体结合区与ACE2的相互作用。美国研究团队还检测了几株SARS病毒受体结合区(receptor-binding domain,RBD)特异性单克隆抗体,发现它们与新型冠状病毒S蛋白的受体结合区没有明显结合,这提示这两种病毒受体结合区之间的抗体交叉反应可能是有限的。

 

因此针对2019-nCoV的S蛋白药物开发,尤其是大分子药物开发,可能没有什么捷径可走,需要一步一步建立模型体系,筛选出有活性的药物。

 

针对S蛋白和ACE2的结合阻断,我们可以开发生化水平的检测,比如两种蛋白的结合阻断ELISA,那是否有细胞水平的模型?最真实的模拟病毒侵染细胞的过程,进而阻断,来反应药物的效果呢?答案是有的。

 

科佰生物开发了一种表达S蛋白的假病毒,该假病毒依靠S蛋白侵染目的细胞,与目的细胞结合,进而杀死目的细胞,检测到信号,最大限度的模拟病毒的感染过程。同时该假病毒没有致病性,只需要P2级实验室即可,是用于药物研发最合适的细胞水平的评估模型。

 

 

对应的产品线

 

 

 

2019-nCoV新型冠状病毒已然是全球人的公敌,看着前线医务人员的付出,希望我们生物人,也能贡献自己的力量。

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