慢病毒整合稳定细胞株

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▏ 名词定义

慢病毒：慢病毒是一种逆转录病毒，属于逆转录病毒科。慢病毒表达逆转录酶和整合酶，前者将病毒RNA转化为双链DNA，后者将病毒DNA插入宿主DNA，会随宿主细胞一起分裂。这一特性可用于将各种基因、突变或治疗药物稳定地递送到细胞中，几十年来已在研究界得到广泛应用。一般认为，逆转录病毒只感染分裂细胞，而慢病毒则同时感染分裂细胞和非分裂细胞。

野生型慢病毒已被改造成可在实验室环境中安全使用的慢病毒载体。这些改造的慢病毒载体具有诸多优势，使其成为多种细胞类型和模型中有用的研究工具。慢病毒载体可以靶向非分裂细胞，能够在宿主细胞中长期稳定表达，并且具有较低的免疫原性。

慢病毒载体： 慢病毒的完整基因组通常8-10kb，由单链RNA编码，包含诸多元件，但是实验用于包装的慢病毒，出于安全性的考虑，许多元件都被突变、移除。

图1 慢病毒的完整基因组元件图示

1. 包装基因包含：gag、pol、env
2. 调控基因包含：tat、rev
3. 辅助基因包含：vif、vpr、vpu、nef

Transfer plasmid	LTR	in cis	Long terminal repeat; comprised of a U3-R-U5 structure and are found on each side of the provirus. The U3 (unique 3’) contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. R is the repeat region.
	U3	in cis	Unique 3’; contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. Removal of this region in the 3’ LTR in third-generation plasmids creates self-inactivating viral vectors.
	R	in cis	Repeat region where Tat binds.
	TAR	in cis	Trans-activating response element; found in the R region and acts as the binding site for Tat.
	U5	in cis	Unique 5'; in third-generation plasmids, this region is often removed in 5’ LTRs and replaced with a heterologous promoter (CMV or RSV).
	5' LTR	in cis	Acts as an RNA pol II promoter; the transcript begins, by definition, at the beginning of R, is capped, and proceeds through U5 and the rest of the provirus. Third-generation plasmids use a hybrid 5' LTR with a constitutive promoter such as CMV or RSV.
	3' LTR	in cis	Terminates transcription started by 5' LTR by the addition of a polyA tract just after the R sequence.
	WPRE	in cis	Woodchuck hepatitis virus post‐transcriptional regulatory element; stimulates the expression of transgenes via increased nuclear export.
	RRE	in cis	Rev Response Element; he sequence to which the Rev protein binds.
	Psi (?)	in cis	RNA packaging signal; recognized by nucleocapsid proteins and essential for efficient viral packaging.
	cPPT	in cis	Central polypurine tract; recognition site for proviral DNA synthesis. Increases transduction efficiency and transgene expression.
Packaging plasmid	gag	in trans	Precursor structural protein of the lentiviral particle containing matrix, capsid, and nucleocapsid components.
	pol	in trans	Precursor protein containing reverse transcriptase and integrase components.
	rev	in trans	Binds to the Rev Response Element (RRE) within unspliced and partially spliced transcripts to facilitate nuclear export. Provided by a separate plasmid from gag/pol in third-generation packaging plasmids.
	tat	in trans	Trans-activator; binds TAR to activate transcription from the LTR promoter. Only in first- and second-generation lentiviral plasmids.
Envelope plasmid	env	in trans	The viral envelope gene; typically vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G), an envelope protein with broad tropism used to pseudotype most lentiviral vectors.

▏ 慢病毒载体的演变

针对实验室中包装慢病毒，就需要将非必需的组份去除，将必需的组份分离到不同的质粒中确保安全。

因此诞生了主流的4代慢病毒包装系统：

第一代质粒包括（图2）：

1.转移质粒——含有转基因和野生型 LTR

2.包装质粒——包含整个病毒基因组（包装、调控和附属基因），仅去除了包膜

3.包膜质粒— 含有env

图2 第一代慢病毒质粒系统

第一代慢病毒质粒缺乏安全性改进以及无法生产具有复制能力的慢病毒（即产生能够感染细胞并进一步自我复制的病毒颗粒），基本已经废弃使用了。

第二代质粒包括（图3）：
1.转移质粒——含有转基因和野生型 LTR
2.包装质粒— 包含gag、pol、tat和rev
3.包膜质粒— 含有env

图3 第二代慢病毒质粒系统

第二代慢病毒质粒通过去除辅助基因，大大提高了慢病毒载体生产的安全性。第二代质粒包含tat，因为转移质粒的5' LTR被用作启动子，而这需要Tat才能激活。

第三代质粒包括（图4）：

1.转移质粒——含有转基因和LTR（嵌合5'LTR）

2.包装质粒 1 — 包含gag和pol

3.包装质粒 2 — 包含rev

4.包膜质粒— 含有env

图4 第三代慢病毒质粒系统

第三代系统在几个关键方面进一步提高了第二代系统的安全性。首先，包装系统被拆分成两个质粒。虽然更安全，但该系统使用起来可能更麻烦，并且由于额外的质粒导致病毒滴度较低。其次，第三代系统不需要tat。相反，转移质粒包含一个与异源启动子（通常是CMV或RSV）融合的嵌合5'LTR，从而无需Tat的反式激活。

大多数第三代转移质粒也含有3' LTR的缺失，使其具有自失活性（SIN）。该缺失在一轮逆转录后转移到5' LTR，从而抑制病毒整合到宿主基因组后全长病毒的转录。这种情况在第二代转移质粒中也常见。

第四代质粒包括（图5）：

图5 第四代慢病毒质粒系统

第四代包装系统针对病毒产量、易用性和安全性进行了优化。首先系统采用了四环素（Tet系统启动子）转录激活表达，其次同样也采用了Tat反式激活因子驱动病毒的必需成份的高表达，第三gap-pro和vpr-pol被分离到两个质粒上，这次生产复制型慢病毒需要三次低频重组，更安全。而滴度，有报道称，可以达到5*10e8 IFU/mL(未浓缩上清)。

综上，经过历代的慢病毒载体的演变升级，现有的第四代包装系统成为主流的实验室慢病毒包装系统，不管是安全性，还是产量，都是比较有保障的。

▏ 包装的宿主细胞

1.包装慢病毒需要选择生产细胞系，常用的生产细胞是HEK293T，相比于HEK293而言，因为HEK293T存在SV40大T抗原，可以使得含有SV40复制起点的质粒进行游离型复制，产生更高的拷贝数，同时HEK293T具有更高的转染效率，也能支持更高的病毒滴度。

2.293T/17是293T的亚克隆，同样也表达SV40大T抗原，因为克隆17在测试中发现具有更高的转染性，而被筛选出来。

3.293FT也是293T的衍生细胞，是一种快速生长的变体，同样也表达SV40大T抗原。

4.Lenti-X 293也是293T的衍生细胞，表达SV40大T抗原，据报道称，由Lenti-X 293包装的慢病毒比293FT多6倍。

5.悬浮293T细胞和各类衍生悬浮细胞，悬浮细胞可以做到更高的密度，可以扩展到生物反应器培养，而且是无血清培养，利于下游的纯化和浓缩。

6.稳定生产细胞株，在宿主中稳定整合了必要的包装元件，从而简化了生产流程，病毒的批次稳定性好，不需要像瞬转一样每次单独包装。

图6 慢病毒包装图示

▏ 纯化和浓缩

在下一步的慢病毒感染靶点细胞中，所需要的病毒滴度比较高，也比较纯，因此收集到的病毒上清液还需要做进一步的纯化和浓缩。

病毒颗粒的收集和浓缩方法多种多样，常见的技术包括离心、过滤、沉淀和免疫捕获。方法的选择取决于病毒类型、样本量以及所需的纯度和浓度等因素。一些方法，例如超速离心，可以提供高纯度，但可能耗时；而另一些方法，例如聚乙二醇沉淀，速度更快，但可能无法达到相同的纯度。较新的技术，例如使用磁性纳米粒子的技术，可以快速、高产量地进行浓缩，并且操作最少。

以下是一些关键方法的详细介绍：

1.离心：

差速离心：

该方法使用不同速度的离心，根据大小和密度将病毒与细胞碎片和其他成分分离。

超速离心：

该技术采用极高的速度使病毒颗粒化，从而实现浓缩和净化。

离心超滤：

该方法利用具有特定分子量截止值的膜来过滤掉较大的颗粒并浓缩病毒。

2.过滤：

切向流过滤：该方法使用膜将病毒颗粒从大量液体中分离出来，从而实现连续流动和浓缩。

膜吸附/洗脱：病毒可以吸附到特定的膜过滤器上，然后使用适当的缓冲液洗脱。

3.沉淀：

聚乙二醇（PEG）沉淀：PEG 用于从溶液中沉淀病毒，以便收集和浓缩病毒。

共沉淀：在某些情况下，病毒可以与其他物质（例如蛋白质）共沉淀，以增强浓度。

4.免疫捕获：

基于抗体的捕获：可以使用特异性结合病毒的抗体捕获病毒，从而实现病毒的分离和浓缩。

5.其他方法：

磁性纳米粒子：这些纳米粒子可用于捕获和浓缩病毒，提供快速有效的浓缩。

声学分离：该方法利用声波根据大小和密度分离颗粒，可能提供一种温和有效的病毒浓缩方法。

水基冷凝：这项较新技术正在开发中，用于对空气中的病毒进行采样。

▏ 滴度的检测

病毒滴度是衡量传染性病毒颗粒浓度的指标，病毒经过浓缩，滴度比较高，在感染靶细胞之前，需要通过检测判断出浓缩后的病毒的滴度。检测病毒滴度的方法很多，这些方法包括斑块测定、病灶测定以及量化病毒传染性或病毒颗粒的各种其他技术。

1. 斑块测定：

该方法涉及用病毒样本的连续稀释液感染单层宿主细胞。

孵育后，可见的斑块（细胞裂解或死亡的区域）形成，并计算斑块的数量。

滴度是根据斑块数量、稀释倍数和所用病毒量计算得出的。

2. 焦点分析：

与斑块测定类似，该方法量化了感染后形成的病灶（感染细胞的区域）的数量。

通过计数焦点并考虑稀释度和体积来确定滴度。

3.其他方法：

qPCR：量化病毒 RNA 或 DNA，提供总病毒颗粒的测量值。

ELISA：检测病毒抗原，提供量化病毒载量的方法。

流式细胞术：可用于计数单个感染细胞，尤其是表达荧光标记的细胞。

图7 慢病毒包装上清液中存在的产物。物理方法可以测量上清液中释放的功能性和非功能性颗粒，以及游离衣壳蛋白（例如 p24）。功能性滴定方法专门测量功能性病毒颗粒。

需要注意的是：

1.感染性滴度与物理滴度：

一些方法测量感染性病毒颗粒的数量（感染滴度），而另一些方法测量病毒颗粒总量（物理滴度），传染滴度更能反应病毒的感染转导功能，但是一般检测传染滴度所需时间较长，而检测物理滴度很快，因此有一类方法是建立“感染滴度”和“物理滴度”之间的换算关系。

2.空斑形成单位 (PFU)、转导单位 (TU) 和感染单位 (IFU) 有什么区别？哪一个更能反映活性病毒的用量？

1）PFU（空斑形成单位）表示感染性或活病毒的数量。PFU/ml，通过测量病毒感染后的空斑数量来校准病毒滴度，反映制剂中有效的病毒数量。

2）IFU（感染单位）相当于PFU。

3）TU/ml：转导单位/ml，表示每毫升病毒毒液中具有生物活性的病毒颗粒数量，即可感染并进入靶细胞的病毒基因组数量。这是慢病毒的常用计量单位，可以反映制剂中工作病毒的数量。

IFU 的数量通常低于TU的数量，因为并非所有进入细胞的病毒颗粒都能成功引发有效感染。

▏ 感染靶点细胞

慢病毒转导涉及将靶基因整合到宿主基因组中，这得益于修饰慢病毒载体内编码的逆转录酶和整合酶，从而实现外源基因的持续表达。与其他病毒载体不同，慢病毒能够转导非分裂细胞，这在基因递送应用中具有独特的优势。

在构建稳定细胞株过程中，慢病毒侵染宿主细胞，经过反转录形成的DNA，部分是游离在细胞中，部分是在整合酶的作用下，将慢病毒载体中的5’LTR到3’LTR的序列整合进宿主的基因组中，在选择性抗性的筛选下，未整合的细胞会被杀死，活下来的细胞可以扩增以构建稳定细胞株，有研究表明：随着细胞的分裂，大约需要10-14天，未整合的DNA才会降解干净，同时也是常见抗性的加压筛选周期。

慢病毒（LV）是一种有包膜的病毒，最常见的是VSV-G，它通过与特定的细胞表面蛋白（比如LDLR）结合，随后进行膜融合进入细胞，将含有其遗传信息的病毒RNA注入细胞质。这种单链病毒RNA通过逆转录转化为DNA。病毒DNA进入细胞核，并通过病毒整合酶整合到宿主细胞基因组中。

图8 慢病毒整合宿主基因组的图示

▏ 实验中的关键考虑因素

1.MOI 选择：MOI过低会导致转导效率低下，而MOI过高则可能产生细胞毒性，需要进行MOI滴定实验以确定最佳感染条件。

2.聚凝胺用途：Polybrene是一种聚阳离子，可以降低病毒与细胞膜之间的电荷排斥，进而提高转导效率，但如果剂量不当，也可能导致细胞损伤。

3.选择时机：一旦细胞活力恢复，就实施转导，尽快保证细胞在增殖活跃期。

4.细胞密度控制：细胞密度过高会增加转导成本，而密度过低则可能影响效率，建议细胞密度保持在1-2×(10^5)细胞/毫升左右。

5.病毒浓度和滴度：慢病毒的滴度直接影响转导效率，强调了了解病毒滴度和控制病毒添加的重要性。

6.关于整合：病毒整合的全基因组研究表明，慢病毒最常整合到转录活性区域、近期参与易位事件的区域以及其他“脆弱”的基因组位置，并且这种偏好在目标物种之间是保守的。尽管已知整合的普遍倾向，但它仍然是随机的且难以预测。

最后：

由于慢病毒载体能够整合并长期表达转基因，因此是有用的研究和临床工具。常见的应用有：稳定细胞株构建、递送CRISPR文库、小鼠建模、基因治疗等等。

慢病毒转导是一种稳定可靠的基因递送方法，适用于多种细胞类型，包括通常对其他转导方法产生抗性的非分裂细胞。通过精心的实验设计和优化，可以显著提高转导效率和后续基因表达的稳定性。

▏ 稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“慢病毒整合系统”稳定细胞株构建服务，利用该系统，我们已经成功构建超过900株稳定细胞株的模型，有着丰富的经验，欢迎沟通咨询。

		质粒转染		病毒感染	Flp-FRT系统	转座子系统	基因编辑
		脂质体	电转	慢病毒	Flp-FRT系统	转座子系统	基因编辑
适用细胞		部分细胞	几乎所有细胞	几乎所有细胞	内部4种细胞	几乎所有细胞	部分细胞
转染/感染效率		低	中	高	高	高	低
随机整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等级		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因装载能力		-	-	<4-5k	-	-	-
阳性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包装	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆筛选	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	单克隆筛选	>3 周	>3 周	>3 周	可选	可选	>3 周
	合计	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作负荷		高	中	中	低	低	高

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