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质粒随机整合稳定细胞株

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定义

质粒转染是一种将质粒DNA导入细胞的技术,使科学家能够研究基因功能、表达和细胞效应。它涉及使用非病毒方法将外来DNA导入细胞,例如电穿孔或化学试剂。
 

如下我们重点介绍化学试剂介导下的质粒转染,电穿孔另开主题介绍。


基本原理

我们经常使用的转染化学试剂有Lipofectamine/CaPO4/FuGene/PEI等,原理基本是相同的:

1. 在体外混合质粒和转染试剂,质粒DNA带负电荷,转染试剂带正电荷,由转染试剂包裹质粒DNA在体外形成稳定的复合物;

2. 外围带正电荷的复合物,接触到带负电荷的细胞膜,穿透细胞膜,形成Endosome(一种真核细胞内的膜结合细胞器,属于囊泡结构,是细胞内吞作用中物质运输的关键环节);

3. 在细胞质内释放外源的质粒DNA,DNA通过核孔进入细胞核,参与外源基因的表达。

 



 

瞬时表达和稳定整合表达

 

 

常见质粒转染,没有定点的、特殊的整合机制,因此当质粒被递送到细胞核中,整合是随机发生的,而且只有一小部分质粒会随着细胞DNA复制过程中的断裂,经过修复机制的作用,被整合到宿主的染色体基因组中。
 

因此我们总结几个重要的特点

1. 随机整合,整合效率低,不一定会整合到转录活跃区;

2. 大量未整合的质粒(以1x10e6转染5 μg为例,以pcDNA3.1载体加上3000bp的目的基因为例,大约是5.37*10e11 copies),随着细胞分裂慢慢被稀释或降解;

3. 一般24-96小时会形成一个瞬时表达的最高峰;

4. 被整合的拷贝需要经过抗性(antibiotic)筛选得到阳性细胞,并且后期需要抗性维持压力;

5. 因为是通过DNA断裂修复重组进去的,所以后期也存在这个位置再次断裂的可能性,进而破坏了目的基因,因此可以说稳定性是个挑战,建议做单克隆稳定细胞株,做传代稳定性分析;

6. 线性DNA比环状DNA整合得更有效率,但是线性DNA比环状DNA更难递送;

7. 不同细胞类型差异较大,表现在“递送差异”和“整合差异”上;

8. 递送的化学试剂,多少存在毒性,需要平衡递送效率和毒性;

9. 被递送的质粒要去内毒素,内毒素会引起免疫反应。

 




应用场景

1

瞬时转染,追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达

2

稳定细胞株构建,生物安全等级低,对整和效率、整合位置要求不高


 

稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“质粒随机整合系统”稳定细胞株构建服务,利用该系统,我们已经成功构建超过500株稳定细胞株的模型,有着丰富的经验,欢迎沟通咨询。


质粒转染

病毒感染

Flp-FRT系统

转座子系统

基因编辑

脂质体

电转

慢病毒

适用细胞

部分细胞

几乎所有细胞

几乎所有细胞

内部4种细胞

几乎所有细胞

部分细胞

转染/感染效率

随机整合

-

生物安全等级

BL1

BL1

BL2

BL1

BL1

BL1

基因装载能力

-

-

<4-5k

-

-

-

阳性率

周期

基因合成

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

病毒包装

-

-

1

-

-

-

混合克隆筛选

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

单克隆筛选

>3 

>3 

>3 

可选

可选

>3 

合计

> 8-10 

> 8-10 

>9-11

5-7 

5-7 

> 8-10 

工作负荷


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