质粒随机整合稳定细胞株
▏ 定义
质粒转染是一种将质粒DNA导入细胞的技术,使科学家能够研究基因功能、表达和细胞效应。它涉及使用非病毒方法将外来DNA导入细胞,例如电穿孔或化学试剂。
如下我们重点介绍化学试剂介导下的质粒转染,电穿孔另开主题介绍。
▏ 基本原理
我们经常使用的转染化学试剂有Lipofectamine/CaPO4/FuGene/PEI等,原理基本是相同的: 1. 在体外混合质粒和转染试剂,质粒DNA带负电荷,转染试剂带正电荷,由转染试剂包裹质粒DNA在体外形成稳定的复合物; 2. 外围带正电荷的复合物,接触到带负电荷的细胞膜,穿透细胞膜,形成Endosome(一种真核细胞内的膜结合细胞器,属于囊泡结构,是细胞内吞作用中物质运输的关键环节); 3. 在细胞质内释放外源的质粒DNA,DNA通过核孔进入细胞核,参与外源基因的表达。
▏ 瞬时表达和稳定整合表达
常见质粒转染,没有定点的、特殊的整合机制,因此当质粒被递送到细胞核中,整合是随机发生的,而且只有一小部分质粒会随着细胞DNA复制过程中的断裂,经过修复机制的作用,被整合到宿主的染色体基因组中。 因此我们总结几个重要的特点: 1. 随机整合,整合效率低,不一定会整合到转录活跃区; 2. 大量未整合的质粒(以1x10e6转染5 μg为例,以pcDNA3.1载体加上3000bp的目的基因为例,大约是5.37*10e11 copies),随着细胞分裂慢慢被稀释或降解; 3. 一般24-96小时会形成一个瞬时表达的最高峰; 4. 被整合的拷贝需要经过抗性(antibiotic)筛选得到阳性细胞,并且后期需要抗性维持压力; 5. 因为是通过DNA断裂修复重组进去的,所以后期也存在这个位置再次断裂的可能性,进而破坏了目的基因,因此可以说稳定性是个挑战,建议做单克隆稳定细胞株,做传代稳定性分析; 6. 线性DNA比环状DNA整合得更有效率,但是线性DNA比环状DNA更难递送; 7. 不同细胞类型差异较大,表现在“递送差异”和“整合差异”上; 8. 递送的化学试剂,多少存在毒性,需要平衡递送效率和毒性; 9. 被递送的质粒要去内毒素,内毒素会引起免疫反应。
▏ 应用场景
1 瞬时转染,追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达 2 稳定细胞株构建,生物安全等级低,对整和效率、整合位置要求不高
▏ 稳定细胞株构建服务
科佰生物提供“质粒随机整合系统”稳定细胞株构建服务,利用该系统,我们已经成功构建超过500株稳定细胞株的模型,有着丰富的经验,欢迎沟通咨询。 质粒转染 病毒感染 Flp-FRT系统 转座子系统 基因编辑 脂质体 电转 慢病毒 适用细胞 部分细胞 几乎所有细胞 几乎所有细胞 内部4种细胞 几乎所有细胞 部分细胞 转染/感染效率 低 中 高 高 高 低 随机整合 是 是 是 否 - 否 生物安全等级 BL1 BL1 BL2 BL1 BL1 BL1 基因装载能力 - - <4-5k - - - 阳性率 低 高 高 高 高 低 周期 基因合成 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 病毒包装 - - 1周 - - - 混合克隆筛选 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 单克隆筛选 >3 周 >3 周 >3 周 可选 可选 >3 周 合计 > 8-10 周 > 8-10 周 >9-11周 5-7 周 5-7 周 > 8-10 周 工作负荷 高 中 中 低 低 高