质粒随机整合稳定细胞株

▏ 定义

▏ 基本原理

我们经常使用的转染化学试剂有Lipofectamine/CaPO₄/FuGene/PEI等，原理基本是相同的：

1. 在体外混合质粒和转染试剂，质粒DNA带负电荷，转染试剂带正电荷，由转染试剂包裹质粒DNA在体外形成稳定的复合物；

2. 外围带正电荷的复合物，接触到带负电荷的细胞膜，穿透细胞膜，形成Endosome（一种真核细胞内的膜结合细胞器，属于囊泡结构，是细胞内吞作用中物质运输的关键环节）；

3. 在细胞质内释放外源的质粒DNA，DNA通过核孔进入细胞核，参与外源基因的表达。

 

 

▏ 瞬时表达和稳定整合表达

 

 

 

常见质粒转染，没有定点的、特殊的整合机制，因此当质粒被递送到细胞核中，整合是随机发生的，而且只有一小部分质粒会随着细胞DNA复制过程中的断裂，经过修复机制的作用，被整合到宿主的染色体基因组中。
 

因此我们总结几个重要的特点：

1. 随机整合，整合效率低，不一定会整合到转录活跃区；

2. 大量未整合的质粒（以1x10e6转染5 μg为例，以pcDNA3.1载体加上3000bp的目的基因为例，大约是5.37*10e11 copies），随着细胞分裂慢慢被稀释或降解；

3. 一般24-96小时会形成一个瞬时表达的最高峰；

4. 被整合的拷贝需要经过抗性（antibiotic）筛选得到阳性细胞，并且后期需要抗性维持压力；

5. 因为是通过DNA断裂修复重组进去的，所以后期也存在这个位置再次断裂的可能性，进而破坏了目的基因，因此可以说稳定性是个挑战，建议做单克隆稳定细胞株，做传代稳定性分析；

6. 线性DNA比环状DNA整合得更有效率，但是线性DNA比环状DNA更难递送；

7. 不同细胞类型差异较大，表现在“递送差异”和“整合差异”上；

8. 递送的化学试剂，多少存在毒性，需要平衡递送效率和毒性；

9. 被递送的质粒要去内毒素，内毒素会引起免疫反应。

  

▏ 应用场景

1

瞬时转染，追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达

2

稳定细胞株构建，生物安全等级低，对整和效率、整合位置要求不高


 

▏ 稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“质粒随机整合系统”稳定细胞株构建服务，利用该系统，我们已经成功构建超过500株稳定细胞株的模型，有着丰富的经验，欢迎沟通咨询。

		质粒转染		病毒感染	Flp-FRT系统	转座子系统	基因编辑
		脂质体	电转	慢病毒
适用细胞		部分细胞	几乎所有细胞	几乎所有细胞	内部4种细胞	几乎所有细胞	部分细胞
转染/感染效率		低	中	高	高	高	低
随机整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等级		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因装载能力		-	-	<4-5k	-	-	-
阳性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包装	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆筛选	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	单克隆筛选	>3 周	>3 周	>3 周	可选	可选	>3 周
	合计	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作负荷		高	中	中	低	低	高