质粒电转整合稳定细胞株
▏ 名词定义
电穿孔,也称为电通透化,是一种高效的非病毒递送系统,可使遗传物质(DNA和RNA)、蛋白质、药物或其他分子进入细胞。它利用精确的脉冲电流在细胞膜上制造临时孔隙,使分子能够通过。
一旦质粒DNA进入细胞,就可能作用于细胞。遗传物质可能保持独立(以质粒的形式,未整合),也可能根据后续实验步骤整合到宿主基因组中。
▏ 工作原理
体外电穿孔时,将靶细胞悬浮液与待导入细胞的质粒DNA在导电溶液中混合,然后放入比色皿中(图1)。电穿孔比色皿的样品室两侧各有一块金属板,电流可以通过混合物。将比色皿放入电穿孔仪的腔室中,该腔室配有相应的电触点,使比色皿形成电路。电穿孔仪上的控制器允许用户设置待输送电脉冲的电压、波形和持续时间,这些参数应根据靶细胞类型进行优化。然后,电脉冲通过样品室。

图 1:装有比色皿的电穿孔仪主要部件示意图。图片来源:Richard Wheeler
电脉冲扰乱细胞膜的磷脂双层,从而形成孔隙(图 2)。这种过程是不对称的,孔隙首先在细胞的阳极侧形成。同时,跨膜电位增加。这驱使带电分子(例如质粒DNA)首先吸附到细胞阴极侧的膜上,然后穿过这些孔隙进入细胞 (图 3)。
图2:电穿孔过程中细胞膜破坏和孔隙形成的示意图。图片来源:Technology Networks。
▏ 优缺点
优点 |
缺点 |
操作相对简单 |
需要专用仪器 |
对转染难度较大的细胞类型效果良好 |
参数必须经过仔细优化 |
无载体要求,甚至不需要载体 |
对细胞损伤较大,部分无法恢复而死亡 |
对细胞类型的依赖性小 |
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快递转染大量细胞,相对成本低 |
/ |
可以转染含有细胞壁的物种 |
/ |
▏ 关键参数
制定电穿孔方案时,重要的是选择合适的参数,使其能够实现通透性,同时最大程度地减少对细胞膜的干扰,以最大限度地提高细胞活力、实验可重复性和效率。需要考虑的因素包括:
1. 波形:指数衰减脉冲、方波脉冲
方波脉冲迅速上升到设定电压,维持该水平,然后在脉冲结束时迅速截止;指数衰减波的电压迅速上升到目标值,然后随时间下降。一般而言,哺乳动物转染选择方波脉冲比较多;
2. 脉冲时间:针对方波脉冲,一般是直接设置持续时间;指数衰减脉冲会随着时间延长,电压逐渐降低,一般用时间常数TC表示,需要结合对细胞的损伤来优化;
3. 场强:指施加于电极间隙的电压,这个电压跟很多因素有关,比如比色皿的间隙、细胞的大小、温度等。
4. 缓冲液:缓冲液的电阻、盐浓度、缓存能力都会影响电转效果,比如有些敏感细胞更喜欢培养基组份;
5. 温度:高功率一般倾向于低温,比如冰上操作;
6. pH变化:电极电解可能引起pH变化,可以通过缓冲液调整;
7. 细胞数量:细胞过密会导致电弧放电,过稀会降低阳性比率;
8. 细胞质量:因为电转本身对细胞有损伤,因此被电转的细胞质量尤为重要,一般是选择健康、无污染、分裂活跃、代数低的细胞;
9. 质粒质量:质量差或者污染的质粒DNA会降低电转效率;
其他:比色皿表面的水份、高盐、气泡等,都可以引起电弧放电。
▏ 瞬时表达和稳定整合
▏ 应用场景
1 瞬时转染,追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达; 2 稳定细胞株构建,生物安全等级低,对整和效率、整合位置要求不高。
▏ 稳定细胞株构建服务
科佰生物提供“质粒电转整合系统”稳定细胞株构建服务,利用该系统,我们已经成功构建超过300株稳定细胞株的模型,有着丰富的经验,欢迎沟通咨询。
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质粒转染 |
病毒感染 |
Flp-FRT系统 |
转座子系统 |
基因编辑 |
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脂质体 |
电转 |
慢病毒 |
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适用细胞 |
部分细胞 |
几乎所有细胞 |
几乎所有细胞 |
内部4种细胞 |
几乎所有细胞 |
部分细胞 |
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转染/感染效率 |
低 |
中 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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随机整合 |
是 |
是 |
是 |
否 |
- |
否 |
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生物安全等级 |
BL1 |
BL1 |
BL2 |
BL1 |
BL1 |
BL1 |
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基因装载能力 |
- |
- |
<4-5k |
- |
- |
- |
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阳性率 |
低 |
高 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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周期 |
基因合成 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
病毒包装 |
- |
- |
1周 |
- |
- |
- |
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混合克隆筛选 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
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单克隆筛选 |
>3 周 |
>3 周 |
>3 周 |
可选 |
可选 |
>3 周 |
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合计 |
> 8-10 周 |
> 8-10 周 |
>9-11周 |
5-7 周 |
5-7 周 |
> 8-10 周 |
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工作负荷 |
高 |
中 |
中 |
低 |
低 |
高 |