首页/技术服务/稳定细胞株构建/质粒电转整合稳定细胞株

质粒电转整合稳定细胞株

产品描述
周期报价
案例展示

名词定义

电穿孔,也称为电通透化,是一种高效的非病毒递送系统,可使遗传物质(DNA和RNA)、蛋白质、药物或其他分子进入细胞。它利用精确的脉冲电流在细胞膜上制造临时孔隙,使分子能够通过。
 

一旦质粒DNA进入细胞,就可能作用于细胞。遗传物质可能保持独立(以质粒的形式,未整合),也可能根据后续实验步骤整合到宿主基因组中。




工作原理

     
      体外电穿孔时,将靶细胞悬浮液与待导入细胞的质粒DNA在导电溶液中混合,然后放入比色皿中(图1)。电穿孔比色皿的样品室两侧各有一块金属板,电流可以通过混合物。将比色皿放入电穿孔仪的腔室中,该腔室配有相应的电触点,使比色皿形成电路。电穿孔仪上的控制器允许用户设置待输送电脉冲的电压、波形和持续时间,这些参数应根据靶细胞类型进行优化。然后,电脉冲通过样品室。



图 1:装有比色皿的电穿孔仪主要部件示意图。图片来源:Richard Wheeler
 

      电脉冲扰乱细胞膜的磷脂双层,从而形成孔隙(图 2)。这种过程是不对称的,孔隙首先在细胞的阳极侧形成。同时,跨膜电位增加。这驱使带电分子(例如质粒DNA)首先吸附到细胞阴极侧的膜上,然后穿过这些孔隙进入细胞 (图 3)。
 


图2:电穿孔过程中细胞膜破坏和孔隙形成的示意图。图片来源:Technology Networks。

图3:示意图显示了电穿孔过程中将外源物质(在本例中为质粒)引入细胞的步骤和相关电荷。图片来源:Technology Networks。
 

优缺点

优点

缺点

操作相对简单

需要专用仪器

对转染难度较大的细胞类型效果良好

参数必须经过仔细优化

无载体要求,甚至不需要载体

对细胞损伤较大,部分无法恢复而死亡

对细胞类型的依赖性小

/

快递转染大量细胞,相对成本低

/

可以转染含有细胞壁的物种

/



关键参数

      制定电穿孔方案时,重要的是选择合适的参数,使其能够实现通透性,同时最大程度地减少对细胞膜的干扰,以最大限度地提高细胞活力、实验可重复性和效率。需要考虑的因素包括:

1. 波形:指数衰减脉冲、方波脉冲

方波脉冲迅速上升到设定电压,维持该水平,然后在脉冲结束时迅速截止;指数衰减波的电压迅速上升到目标值,然后随时间下降。一般而言,哺乳动物转染选择方波脉冲比较多;

2. 脉冲时间:针对方波脉冲,一般是直接设置持续时间;指数衰减脉冲会随着时间延长,电压逐渐降低,一般用时间常数TC表示,需要结合对细胞的损伤来优化;

3. 场强:指施加于电极间隙的电压,这个电压跟很多因素有关,比如比色皿的间隙、细胞的大小、温度等。

4. 缓冲液:缓冲液的电阻、盐浓度、缓存能力都会影响电转效果,比如有些敏感细胞更喜欢培养基组份;

5. 温度:高功率一般倾向于低温,比如冰上操作;

6. pH变化:电极电解可能引起pH变化,可以通过缓冲液调整;

7. 细胞数量:细胞过密会导致电弧放电,过稀会降低阳性比率;

8. 细胞质量:因为电转本身对细胞有损伤,因此被电转的细胞质量尤为重要,一般是选择健康、无污染、分裂活跃、代数低的细胞;

9. 质粒质量:质量差或者污染的质粒DNA会降低电转效率;

其他:比色皿表面的水份、高盐、气泡等,都可以引起电弧放电。

 

瞬时表达和稳定整合

      常见质粒转染,没有定点的、特殊的整合机制,因此当质粒被递送到细胞核中,整合是随机发生的,而且只有一小部分质粒会随着细胞DNA复制过程中的断裂,经过修复机制的作用,被整合到宿主的染色体基因组中。
 
      因此我们总结几个重要的特点:
1.随机整合,整合效率低,不一定会整合到转录活跃区;
2.大量未整合的质粒(以1x10e6转染5 μg为例,以pcDNA3.1载体加上3000bp的目的基因为例,大约是5.37*10e11 copies),随着细胞分裂慢慢被稀释或降解;
3.一般24-96小时会形成一个瞬时表达的最高峰;
4.被整合的拷贝需要经过抗性(antibiotic)筛选得到阳性细胞,并且后期需要抗性维持压力;
5.因为是通过DNA断裂修复重组进去的,所以后期也存在这个位置再次断裂的可能性,进而破坏了目的基因,因此可以说稳定性是个挑战,建议做单克隆稳定细胞株,做传代稳定性分析;
6.线性DNA比环状DNA整合得更有效率,但是线性DNA比环状DNA更难递送;
7.不同细胞类型差异较大,表现在“递送差异”和“整合差异”上;
8.被递送的质粒要去内毒素,内毒素会引起免疫反应。

 

应用场景

1

瞬时转染,追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达;

2

稳定细胞株构建,生物安全等级低,对整和效率、整合位置要求不高。


 

稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“质粒电转整合系统”稳定细胞株构建服务,利用该系统,我们已经成功构建超过300株稳定细胞株的模型,有着丰富的经验,欢迎沟通咨询。


质粒转染

病毒感染

Flp-FRT系统

转座子系统

基因编辑

 

脂质体

电转

慢病毒

适用细胞

部分细胞

几乎所有细胞

几乎所有细胞

内部4种细胞

几乎所有细胞

部分细胞

转染/感染效率

随机整合

-

生物安全等级

BL1

BL1

BL2

BL1

BL1

BL1

基因装载能力

-

-

<4-5k

-

-

-

阳性率

周期

基因合成

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

病毒包装

-

-

1

-

-

-

混合克隆筛选

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

单克隆筛选

>3

>3

>3

可选

可选

>3

合计

> 8-10

> 8-10

>9-11

5-7

5-7

> 8-10

工作负荷


如果您有意订购,请联系我们

联系方式:4008-750-250

手机:180-6607-1954

邮箱:sales@cobioer.com

返回列表

客服

微信

扫一扫,添加二维码

电话

留言

药靶模型联系方式: 华东销售经理(上海):18240630236 华东销售经理(上海、江苏、安徽):15715191010 华中&华西销售经理:18071545918 华中&西南销售经理:13871580511 华北销售经理:18628311252 全国销售经理:13816461235
诊断标准品联系方式: 华东销售经理:15000320447 华北销售经理:18628311252 华中&华西销售经理:18071545918 华中&西南销售经理:13871580511 全国销售经理:13816461235

扫二维码