质粒电转整合稳定细胞株

▏ 名词定义

▏ 工作原理

     
      体外电穿孔时，将靶细胞悬浮液与待导入细胞的质粒DNA在导电溶液中混合，然后放入比色皿中（图1）。电穿孔比色皿的样品室两侧各有一块金属板，电流可以通过混合物。将比色皿放入电穿孔仪的腔室中，该腔室配有相应的电触点，使比色皿形成电路。电穿孔仪上的控制器允许用户设置待输送电脉冲的电压、波形和持续时间，这些参数应根据靶细胞类型进行优化。然后，电脉冲通过样品室。

▏ 优缺点

优点	缺点
操作相对简单	需要专用仪器
对转染难度较大的细胞类型效果良好	参数必须经过仔细优化
无载体要求，甚至不需要载体	对细胞损伤较大，部分无法恢复而死亡
对细胞类型的依赖性小	/
快递转染大量细胞，相对成本低	/
可以转染含有细胞壁的物种	/

▏ 关键参数

      制定电穿孔方案时，重要的是选择合适的参数，使其能够实现通透性，同时最大程度地减少对细胞膜的干扰，以最大限度地提高细胞活力、实验可重复性和效率。需要考虑的因素包括：

1. 波形：指数衰减脉冲、方波脉冲

方波脉冲迅速上升到设定电压，维持该水平，然后在脉冲结束时迅速截止；指数衰减波的电压迅速上升到目标值，然后随时间下降。一般而言，哺乳动物转染选择方波脉冲比较多；

2. 脉冲时间：针对方波脉冲，一般是直接设置持续时间；指数衰减脉冲会随着时间延长，电压逐渐降低，一般用时间常数TC表示，需要结合对细胞的损伤来优化；

3. 场强：指施加于电极间隙的电压，这个电压跟很多因素有关，比如比色皿的间隙、细胞的大小、温度等。

4. 缓冲液：缓冲液的电阻、盐浓度、缓存能力都会影响电转效果，比如有些敏感细胞更喜欢培养基组份；

5. 温度：高功率一般倾向于低温，比如冰上操作；

6. pH变化：电极电解可能引起pH变化，可以通过缓冲液调整；

7. 细胞数量：细胞过密会导致电弧放电，过稀会降低阳性比率；

8. 细胞质量：因为电转本身对细胞有损伤，因此被电转的细胞质量尤为重要，一般是选择健康、无污染、分裂活跃、代数低的细胞；

9. 质粒质量：质量差或者污染的质粒DNA会降低电转效率；

其他：比色皿表面的水份、高盐、气泡等，都可以引起电弧放电。

 

▏ 瞬时表达和稳定整合

▏ 应用场景

1

瞬时转染，追求瞬间高拷贝/超拷贝的蛋白表达；

2

稳定细胞株构建，生物安全等级低，对整和效率、整合位置要求不高。


 

▏ 稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“质粒电转整合系统”稳定细胞株构建服务，利用该系统，我们已经成功构建超过300株稳定细胞株的模型，有着丰富的经验，欢迎沟通咨询。

		质粒转染		病毒感染	Flp-FRT系统	转座子系统	基因编辑
		脂质体	电转	慢病毒
适用细胞		部分细胞	几乎所有细胞	几乎所有细胞	内部4种细胞	几乎所有细胞	部分细胞
转染/感染效率		低	中	高	高	高	低
随机整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等级		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因装载能力		-	-	<4-5k	-	-	-
阳性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包装	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆筛选	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	单克隆筛选	>3 周	>3 周	>3 周	可选	可选	>3 周
	合计	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作负荷		高	中	中	低	低	高