ADC靶点方法学开发
▏ 什么是ADC药物
ADC（Antibody-drug conjugate，ADC）药物全称为抗体偶联药物，是将抗体通过偶联臂（Linker）与小分子药物（Payload）共价连接的复合物。抗体负责靶向病灶，毒素通过自身特性杀伤目标细胞，连接子则是承担桥接毒素和抗体直至ADC到达肿瘤细胞内再进行释放的功能。一个理想的ADC分子应该具备高靶点特异性、高肿瘤杀伤能力、长药代特性、低免疫原性、低脱靶毒性。
图1. ADC药物的结构图示
▏ ADC药物的作用机制
ADC药物通过静脉注射到血液中，随着血液的流动，到达全身，但是科学家估计只有0.1%的ADC能到达患者的癌细胞。大部分会在循环系统和其他器官及组织中逐渐分解。到达癌细胞的ADC药物一般是经历6个过程来起作用。
1. ADC药物进入血液循环；
2. ADC药物与癌细胞表面抗原结合；
3. ADC药物通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞；
4. 溶酶体通过组织蛋白酶和纤溶酶降解ADC药物；
5. 在癌细胞中释放Payload，药物结合到靶点蛋白；
6. 毒性分子诱导细胞凋亡，细胞破裂，同时部分ADC药物也可能杀死周围的癌细胞。
图2. ADC药物的作用机制模型
▏ ADC药物活性评价平台
1. ADC药物与抗原结合能力检测
1.1 bio-chemical assay
首先在生化水平(bio-chemical assay)上，可以采用ELISA的方式检测ADC药物与抗原的结合能力，常见的有Total Antibody ELISA、Conjugated Antibody ELIA、Conjugated drug ELISA。同样的，针对PPI（Protein-Protein Interaction），biacore是一个强大的工具，可以得到更全面的动力学结合分析数据。
图3. ELISA方法检测ADC药物和抗原靶点的结合
1.2 Cell-based assay
一般生化水平检测完，就需要做细胞水平(Cell-based assay)的结合能力检测,可以选择靶点阳性的细胞来进行，一般可以同时选择不表达、低表达、中表达、高表达的细胞一起做，检测方法一般采用流式细胞术（FACS）来检测。
科佰Cell-Panorama数据库是完全免费开源的数据库，数据库整合了2000多种细胞的RNA-seq数据，我们知道mRNA表达和蛋白表达相关系数只有约0.6左右，因此蛋白组的数据更有参考价值。可贵的是科佰正在构建全国最大的蛋白组数据库（陆续新增中），届时免费向我们的客户公开。
图4. 科佰生物现货肿瘤细胞库组织分类示意图
同时科佰构建了300多株过表达ADC靶点的工程细胞株，全部是现货供应，可以用于多种cell-based assay，比如ELISA、FACS、凋亡、增殖抑制等。
表1. 科佰生物部分现货ADC靶点过表达工程细胞株列表
2. ADC药物的ADCC/ADCP/CDC效应
ADC药物中针对肿瘤相关抗原的抗体，同样也会存在ADCC和ADCP效应。简而言之，抗体的Fab端与肿瘤细胞结合，抗体的Fc端，会与效应细胞的FcγR结合，通过抗体连接肿瘤细胞和效应细胞，则效应细胞就可以释放因子来杀死或者吞噬肿瘤细胞。
图5. ADCC/ADCP/CDC原理示意图
科佰生物开发了多种ADCC/ADCP的模型，采取的是报告基因的检测方法，Luc的报告基因属于化学发光，是一种不需要激发光、本底噪音信号较低的方法学，灵敏度高，适用于ADC药物的检测。
| 货号 | 模型名称 | 应用 |
| CBP74002 | ADCC Bioassay Effector Cell F variant (Low Affinity)- Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74003 | ADCC Bioassay Effector Cell V variant (High Affinity)-Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74076 | Mouse ADCC Bioassay Effector Cell | Functional(Report Gene) Assay |
表2. 科佰生物现货ADCC现货工程细胞株
| 货号 | 模型名称 | 应用 |
| CBP74105 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIa -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74106 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (H variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74004 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (R variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
表3. 科佰生物现货ADCP现货工程细胞株
3. ADC药物的内吞
ADC药物与肿瘤细胞表面的抗原结合后，会触发受体介导的内吞作用，ADC药物被内吞进入溶酶体中，溶酶体提供连接抗体和药物的连接体裂解所需的酸性环境和酶，从而释放细胞毒性有效载荷。常见的内吞机制分为“ 网格蛋白介导的内吞作用”和“不依赖网格蛋白的内吞作用”。
ADC药物的内吞作用是药物起效的前提，内吞动力学的研究能很好的帮助分析药物的内吞过程、内吞效率、监测有效载荷的释放。经典的内吞动力学研究，多用酸性PH敏感的荧光染料来标记ADC抗体。一般而言，胞外的PH为7.4左右，细胞质的PH为7.0-7.2左右，而进入溶酶体后，PH值会有明显的下降，可以达到PH 4.7左右。在中性的环境下，没有荧光，进入溶酶体，变成酸性环境后，PH敏感的荧光染料，就会发出荧光信号。
图6. Incucyte系统，可以长期观察多个时间点和浓度的细胞培养物
4. 载荷的毒性作用评价
ADC药物从溶酶体中释放有效载荷，这些载荷按照预期是可以杀死肿瘤细胞，常见的有效载荷分为几类：
表4. 常见Payload的类型
4.1微管抑制剂(Microtubule Inhibitors):
这类载荷通过干扰细胞微管的正常功能，抑制细胞分裂和增殖。常见的微管抑制剂包括：
MMAE/MMAF:一类auristatin类化合物，通过抑制微管蛋白聚合发挥细胞毒性。
DM1/DM4:一类maytansinoid类化合物，同样作用于微管蛋白。
4.2DNA损伤剂(DNA-damaging agents):
这类载荷通过损伤DNA，导致细胞死亡。常见的DNA损伤剂包括：
卡奇霉素(Calicheamicin):一种内酯类抗生素，通过与DNA结合并产生自由基，导致DNA双链断裂。
吡咯并苯并二氮杂卓类(PBDs):通过与DNA小沟结合，导致DNA交联，阻止DNA复制和转录。?
4.3 拓扑异构酶抑制剂(Topoisomerase Inhibitors):
这类载荷通过抑制拓扑异构酶的活性，影响DNA的复制和转录。常见的拓扑异构酶抑制剂包括：
SN38/DXd:一类喜树碱衍生物，是拓扑异构酶I的抑制剂。
4.4 其他类型的载荷:
除了上述主要类别，还有一些其他类型的载荷正在开发中，例如：RNA聚合酶II抑制剂:通过抑制RNA聚合酶II的活性，影响RNA转录。其他新型细胞毒性药物:例如杜卡霉素、PNU-159682、鹅膏蕈碱等。
不同的载荷有不同的作用机制和毒性特征，因此常见的评价有效载荷的毒性作用，我们可以采取细胞增殖抑制检测、细胞凋亡检测、细胞周期检测等手段。
细胞增殖抑制检测一般采用CTG、CCK8检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制效果。以CTG为例，主要是检测活细胞中的ATP，以荧光素酶的催化发光作为最终的读数，是一种化学自发光的检测，灵敏度高。
图7. CTG法检测ADC药物的肿瘤细胞抑制
细胞凋亡检测有很多方法，常见的有FACS检测Annexin V/PI double staining、检测Caspase、DNA碎片分析、TUNEL等，这些方法可以称为是半定量，一般不适用于四参数拟合，计算药效的EC50。
图8. 通过检测凋亡评定ADC药物的毒性
有些ADC药物的有效载荷是针对DNA复制相关的毒素，就会导致细胞周期的阻滞效果，比如Dxd毒素会导致细胞停滞在G2/M期。
图9. 细胞周期分析ADC药物有效载荷的作用
5. ADC药物的旁观者效应
旁观者效应（Bystander efficacy）是指部分ADC药物的有效载荷在释放后可以渗透穿过细胞膜，进入到肿瘤微环境中，或者阳性细胞凋亡破裂后释放有效载荷，渗透进入靶点阴性的肿瘤细胞并进行杀伤。
旁观者效应在ADC药物的杀伤作用中非常重要，一般用于评价旁观者效应的体外药效的方法有两种：（1）共培养体系，（2）介质转移法。细胞共培养（co-culture)是将两种细胞（抗原阳性Ag+、抗原阴性Ag-）混合共同培养，比较Ag-在共培养系统和单一培养系统中的活力，可以通过检测肿瘤细胞的增殖抑制来比较。介质转移法是先用一定量的ADC处理Ag+细胞，一段时间后，将该介质转移到Ag-细胞。如果来自Ag+细胞的介质对于Ag-比直接用同样浓度的ADC处理体现出更好的杀伤效果，那么就可以说明具有旁观者效应。
以下以共培养体系为例，介绍体外方法学的开发。
5.1 单一培养体系
因为ADC药物的作用机制显示，一来需要ADC药物的抗原结合、内吞、酶切，二来部分有效载荷是跟细胞周期有关，需要细胞积累阻滞，因此一般做旁观者效应之前需要先摸索药物的作用时间（一般建议至少2个倍增周期）和有效浓度，来确保对阳性细胞Ag+细胞的杀伤。
表5. 单一培养体系96孔板Layout设计
通过四参数拟合得到Ag+和Ag-细胞的杀伤曲线，计算出Ag+细胞的IC90，计算出Ag-细胞的IC50，注意这里建议药物的浓度建议使用有效载荷浓度（非ADC药物浓度）来做数据拟合。在下一步的细胞共培养体系中，可以选择大于Ag+细胞IC90、同时小于Ag-细胞的IC50的浓度，来测试旁观者效应。
5.2 共培养体系
在做共培养之前，我们需要明确几点：
① 最好Ag-细胞带Luc的标记，这样届时检测时，只要针对Luc做信号检测即可；
② 因为Ag-的杀伤来自于Ag+细胞的杀伤释放，因此需要摸索不同的Ag+和Ag-共培养的细胞比例关系；
③ 旁观者效应需要的时间更长，如果细胞培养中，涉及添液（不可换液）的操作，则会稀释毒素的浓度，进而影响对Ag-细胞的杀伤；
④ 实验中有各种因素会影响到这种长周期的细胞增殖抑制实验，因此我们一般是通过与Ag-单一细胞模型比较来判断是否存在旁观者效应。
常见的设计如下：
表6. 共培养体系96孔板Layout设计
6. 体内药效评价
体内评价ADC药物的活性，可以将细胞接种到小鼠上，做CDX模型。通过小鼠的皮下瘤、原位瘤的变化来检测ADC药物的药效。同时如果做旁观者效应的话，可以在Ag-的细胞上做Luc的标记，用活体动物成像来检测瘤的变化。
科佰生物提供3类细胞产品助力体内的药效评价，除了1.2中提供的1500多株肿瘤细胞、300多株过表达的工程细胞外，还提供160多种Luc标记的示踪细胞，在接种皮下瘤时，可以通过活体成像来检测瘤子的变化。
表7. 科佰生物部分现货示踪Luc细胞的清单展示
▏ 总结
中国药企在ADC等领域经过多年技术沉淀后，已具备开发first in class（FIC）突破性疗法的实力，并且能够在新兴赛道上担当全球先锋。回顾过去，国内获批的ADC药物更多是fast-follow策略下的成功实践，这类药物也在海外市场获得了一定认可，吃到了一波出海红利，落地了大量BD交易，为国内创新药出海积累了宝贵经验。
表8. 本文思路总结
