首页/技术服务/稳定细胞株构建/Flp-FRT定点整合稳定细胞株

Flp-FRT定点整合稳定细胞株

产品描述
周期报价
案例展示

名词定义

Flp: Flp(flippase recombination enzyme)重组酶,是从酵母细胞内被发现的,其基因全长1272bp,为48kDa大小的、由423个氨基酸组成的多肽单体蛋白。

 

FRT: FRT(Flp Recombination Target)是Flp的识别位点,全长48bp,由3个13bp的反向回文序列和8bp的间隔序列共同组成。与间隔序列相邻的两个反向回文序列是Flp重组酶的识别和结合区域,间隔序列是重组发生的区域,也决定了整个序列的方向。
 


 

Flp-FRT定点整合系统

      Flp-FRT整合系统是一种用于构建稳定细胞系的方法,该细胞系可在宿主细胞基因组的特定位置表达目的基因。该系统利用 Flp 重组酶和 FRT(Flp 重组靶位)位点实现位点特异性重组和整合。该系统可实现目的基因的稳定表达,确保细胞中蛋白质的持续生产。

工作原理

1. Flp-FRT细胞的构建:

将 Flp 重组靶位 (FRT) 位点引入宿主细胞系的基因组中,一般结构是ATG+FRT+抗性基因,根据母细胞选择转染方案,利用抗性筛选,可以得到稳定细胞株。

科佰思考1:一般认为这一步的构建,FRT会整合到细胞的转录活跃区位置,也就是说为了后续的重组外源目的基因的表达,这一步的整合给了外源蛋白过表达提供了一定的保障。

       具体的整合位置可以咨询我们的ISS(integration site search)服务。
 

科佰思考2:作为常规的质粒转染方案,宿主细胞能整合几个拷贝进去?选择几个拷贝为好?一般而言构建Flp-FRT母细胞时,转染后是随机整合,也就是会存在多个拷贝整合到宿主细胞的不同染色体位置。整合的越多,未来目的基因重组整合的也多,也就是表达会更高,但是反过来未来重组目的基因时,多个拷贝的整合效率可能不是100%的,也就是会出现混合克隆(克隆间表达高低不一致),有时针对不需要表达很高的目的蛋白,科佰建议选择1个拷贝的整合克隆,这样未来只要经过抗性筛选的克隆,从原理上说就是单克隆,省去了有限稀释做单克隆的过程。
 

拷贝数检测,可以咨询我们的dPCR检测服务

 

科佰生物内部现货Flp-FRT细胞

 

Cell line

Host cell line

Characteristic

Flp-FRT CHO

CHO-K1

Adherent

Flp-FRT HEK293

HEK293

Adherent

Flp-FRT HCT116

HCT116

Adherent

Flp-FRT Jurkat

Jurkat

Suspension

 

2. 目的基因的整合:

 

将含有目的基因的表达载体、含有Flp重组酶的表达载体共转入第一步中的细胞。在Flp 重组酶的介导下,宿主基因组中的 FRT 位点与表达载体中的 FRT 位点之间的位点特异性重组,达到目的基因整合的目的,在启动子的作用下,稳定表达。

 

载体一:

过表达Flp重组酶,无需抗性,无需稳定整合

 

载体二:

含有目的基因,第二种抗性基因筛选标记

 

重组过程:

 

最终形成:

重组后,可以通过第二种抗性基因来选择得到阳性细胞,改细胞对抗性基因-2耐受,对抗性基因-1敏感

 

 

Flp-FRT系统的优势

1

定点整合,不会随机整合穿插到染色体的任意位置;

2

可控拷贝数,可以通过Flp-FRT细胞的拷贝数来控制目的基因的拷贝数;

3

稳定表达,相对于随机整合,该表达系统更稳定,同时可以同抗性基因2筛选,用抗性基因1验证;

4

表达量高,重组酶整合效率高,且整合在转录活跃区;

5

实验周期短,选择单拷贝的基因组,可以省去有限稀释制备单克隆的过程。

 

稳定细胞株构建服务

科佰生物提供“Flp-FRT定点整合系统”稳定细胞株构建服务,利用该系统,我们已经成功构建超过200株稳定细胞株的模型,有着丰富的经验,欢迎沟通咨询。
 

质粒转染

病毒感染

Flp-FRT系统

转座子系统

基因编辑

脂质体

电转

慢病毒

适用细胞

部分细胞

几乎所有细胞

几乎所有细胞

内部4种细胞

几乎所有细胞

部分细胞

转染/感染效率

随机整合

-

生物安全等级

BL1

BL1

BL2

BL1

BL1

BL1

基因装载能力

-

-

<4-5k

-

-

-

阳性率

周期

基因合成

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

病毒包装

-

-

1

-

 

 

混合克隆筛选

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

单克隆筛选

>3

>3

>3

可选

可选

>3

合计

> 8-10

> 8-10

>9-11

5-7

5-7

> 8-10

工作负荷


 

如果您有意订购,请联系我们

联系方式:4008-750-250

手机:180-6607-1954

邮箱:sales@cobioer.com

返回列表

客服

微信

扫一扫,添加二维码

电话

留言

药靶模型联系方式: 华东销售经理(上海):18240630236 华东销售经理(上海、江苏、安徽):15715191010 华中&华西销售经理:18071545918 华中&西南销售经理:13871580511 华北销售经理:18628311252 全国销售经理:13816461235
诊断标准品联系方式: 华东销售经理:15000320447 华北销售经理:18628311252 华中&华西销售经理:18071545918 华中&西南销售经理:13871580511 全国销售经理:13816461235

扫二维码